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作者：寧雅婷，侯欣，陸旻雅，吳憲，李永哲，徐英春 單位：北京協和醫院檢驗科 通信作者：徐英春 基金項目：中國醫學科學院醫學與健康科技創新工程資助項目（2016-12M-1-014） 新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）是由2019新型冠狀病毒（2019-nCoV）感染引起的以肺部病變為主的新發傳染病，可引起消化系統和神經系統的損傷，嚴重者可導致死亡［1］。 2019年12月以來，疫情進展迅速，截至2020年2月26日24時，我國（港澳臺地區除外）累計報告確診病例78497例，死亡病例2744例，全球疫情亦趨於嚴峻。 ... 目前暫無針對2019-nCoV的有效治療藥物，疫苗也處於臨床試驗階段，早期診斷、及時收治患者對有效控制疫情至關重要［2］。 《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第六版）》推薦實時螢光RT-PCR檢測2019-nCoV核酸陽性是疑似病例確診的診斷條件之一［3］，但該技術對實驗場所及人員要求高、操作繁瑣、耗時長，檢測人員感染風險高，結果受標本質量、實驗條件及人員操作等因素影響較大［4］，核酸單項檢測並不能滿足排查診斷的要求。 ... 圖片來源與「中國軍網」 僅供學習分享 作為機體免疫系統抵抗病毒的重要效應分子，血清特異性抗體是診斷感染的另一關鍵證據。 抗體檢測的操作簡單便捷，對實驗環境及人員要求不甚苛刻，僅需採集血液標本，很大程度上降低醫護人員在標本採集和檢測過程中被感染的風險，是快速篩查和核酸輔助診斷的重要手段［5］。 1抗體產生特點 機體在接觸病毒時，IgM抗體產生最早，但濃度低、維持時間短、親和力較低，是急性期感染的診斷指標；IgG產生晚，但濃度高、維持時間長、親和力高，血清IgG陽性提示感染中後期或既往感染［6-7］。 目前臨床中常用的抗體血清學檢測方法有3種。 2.1酶聯免疫吸附試驗法 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）是將抗原或抗體包被在固相載體表面，利用酶標記的抗體或抗原結合待檢物，並根據酶催化底物產生的有色產物顏色深淺及有無進行分析的一種定性或半定量檢測方法［8］。該檢測方法靈敏度較高，載體標準化難度較低，但檢測速度慢、易污染、步驟較為繁瑣［9］。 2.2化學發光免疫分析法 化學發光免疫分析法是將高靈敏度的化學發光測定技術與高特異性的免疫反應相結合，用於各種抗原、抗體、激素等檢測。該法靈敏度高於ELISA，具有特異性高、線性範圍寬、結果穩定、操作簡化等特點，廣泛應用於臨床標本的檢測［10-11］。 2.3膠體金免疫層析法 膠體金免疫層析法（GICA）是以膠體金為示蹤標誌物，應用於抗原抗體檢測的一種新型免疫標記技術，無需特殊處理標本，僅需一滴血即可在15 min內通過肉眼觀察獲取檢測結果。該方法突破了現有檢測技術對人員、場所的限制，縮短檢測時間，操作方便快速，在基層醫療單位及現場檢測中廣泛使用［10］。 靈敏度反映診斷試驗檢出感染者的能力，若過低，會出現較多假陰性結果，影響疾病的診斷、干預和預後，嚴重可導致患者過早死亡； 特異度衡量診斷試驗正確判斷非感染者的能力，若過低，則會出現較多假陽性結果，導致醫療資源的浪費，並造成患者及群眾的焦慮和恐慌。 因此，具有較高靈敏度和特異度是抗體檢測技術的應用基礎。 3.1靈敏度 抗體檢測的靈敏度主要取決於抗體親和力、檢測方法及操作。 3.1.1抗體親和力 指抗體與抗原的結合能力或強度，IgG親和力高於IgM，免疫結合既快又牢固，不易解離［12］。此外，與單一IgM或IgG抗體檢測相比，IgM-IgG聯合檢測具有更高的實用性和敏感性，可有效提高檢出效率［13］。 3.1.2檢測方法 （1）標記材料：常用的標記物膠體金吸附抗體量較少，限制了檢測靈敏度，建議採用與抗體共價結合的材料，如量子點、吖啶酯，微球等［14-15］。 （2）信號放大系統：選擇高發光強度標記物（如菲羅啉釕摻雜的二氧化矽納米粒子、金納米花），或添加增敏劑（如氯金酸和鹽酸羥胺），標記材料的粒徑也會對靈敏度造成一定影響［16-18］。 （3）試紙條：GICA中，硝酸纖維素膜的孔徑、疏水性、親水性等會影響檢測靈敏度［16,18］。 （4）緩衝液體系：合適的緩衝液體系可穩定抗原抗體的結合能力和抗干擾能力，提高靈敏度。 3.1.3檢測操作 （1）濃縮樣品：通過濃縮方法增加樣品濃度。 （2）抗原抗體反應時間：適當延長反應時間或通過震盪提高反應速率，可使抗原抗體的結合反應達到反應平衡，進而提高靈敏度。 3.2特異度 抗體檢測的特異度主要與抗原位點的選擇有關，目前核衣殼(N）蛋白是2019-nCoV檢測的主要抗原位點。2019-nCoV屬於β冠狀病毒屬B譜系，在系統發育上與蝙蝠SARS樣冠狀病毒(bat-SL-CoVZC45)最接近［19］。N蛋白在β屬冠狀病毒之間相對比較保守，合成數量眾多,具有很強抗原性，在誘導宿主免疫應答甚至發病機制中發揮重要作用，常被用作冠狀病毒診斷的抗原位點［20-21］。 假陽性和假陰性結果會影響臨床診斷。為提高2019-nCoV抗體檢測的準確性，有必要對可能出現的結果及原因進行深入分析。 4.1抗體檢測假陰性 4.1.1防腐劑和抗凝劑： 採用防腐劑疊氮化鈉、抗凝劑EDTA等處理標本，會抑制辣根過氧化物酶（HRP）的活性，造成ELISA假陰性。 4.1.2標本保存不當： 當標本在冰箱中保存過久時，血清中IgG聚合成多聚體，且抗體免疫活性減弱。 4.1.3實驗員操作失誤或試劑盒保存不當： 試劑使用前未平衡至室溫，試劑用量不足，溫育時間或溫度不足；試劑未按規定保存，受到污染或失效等［22］。 4.1.4層析過快： 抗原抗體複合物尚未與檢測線上的抗體結合，就越出檢測線，造成GICA假陰性。 4.2抗體檢測假陽性 4.2.1溶血或紅細胞標本： 紅細胞的細胞內液中各種酶可與底物發生非特異性反應，且血紅蛋白中亞鐵血紅素與HRP活性類似，可催化底物，造成ELISA檢測假陽性［23］；檢測區堆積形成顏色較淺的非特異性條帶，干擾目視法判定膠體金試紙結果［24］。 4.2.2纖維蛋白的影響： 由於標本凝集不全或離心轉速過低、時間太短，血清中的纖維蛋白未完全析出，形成的塊狀或絮狀物堵塞洗板機頭。 4.2.3細菌污染標本： 菌體內可能含有內源性HRP，造成ELISA假陽性結果［23］；此外，疏水性的菌體碎片與金標粒子或捕捉抗體發生結合，影響GICA判讀。 4.2.4患者自身原因： 體內存在自身抗體、嗜異性抗體等，如患有某些基礎疾病或免疫功能異常，或長期服用某種藥物，可產生異常蛋白抗體或特殊物質，如類風濕因子、甲胎蛋白、補體等，具有一定吸附作用，造成抗體檢測假陽性［25］。 ... 核酸與抗體聯合檢測可提高診斷效率，當聯合檢測結果出現以下情況時，需要綜合分析判斷進行結果解讀。 5.1核酸檢測陽性時，抗體檢測出現陰性或陽性結果 5.1.1核酸陽性，IgM和IgG均為陰性 患者可能處於2019-nCoV感染「窗口期」：「窗口期」是指從人體感染病毒後到外周血中能夠檢測出病毒抗體的這段時間，一般為2周。這段時間內無法檢測血液中的病毒抗體，因此，IgM和IgG均為陰性。此時處於感染早期，病毒不斷複製，核酸載量呈指數遞增，達到核酸檢測下限，核酸檢測呈陽性［26-27］。核酸檢測較血清抗體檢測的優勢在於縮短了感染檢出窗口期，可及早發現感染者［28］。 5.1.2核酸陽性，IgM陽性、IgG陰性 患者可能處於2019-nCoV感染早期，機體免疫應答最早產生抗體IgM，暫未產生IgG或IgG含量未達到診斷試劑的檢測下限［29］。 5.1.3核酸陽性，IgM陰性、IgG陽性 患者可能處於2019-nCoV感染中晚期或復發感染。病毒剛入侵人體之時，免疫系統首先會產生臨時性抗體IgM，大約1個月後達峰值，隨著時間的推移，侵入人體的病毒逐漸被IgM中和，IgM逐漸減少，直至低於檢測下限；同時，人體免疫系統會產生持久性抗體IgG，在感染中晚期，IgG為機體免疫的主力軍，濃度高，能夠被檢測到［30］。恢復期IgG較急性期增加4倍及以上時，可診斷為復發感染［5］。 5.1.4核酸陽性，IgM陽性、IgG陽性 患者處於感染活躍期，但人體已對2019-nCoV產生一定免疫能力（持久性抗體IgG已產生）。 5.2核酸檢測陰性時，抗體檢測出現陰性或陽性結果 5.2.1核酸陰性，IgM陽性、IgG陰性 IgM陽性提示極大可能處於2019-nCoV感染急性期，此時需考慮核酸檢測結果存疑。 出現核酸檢測假陰性的原因及應對建議主要有以下幾方面： （1）標本質量差。採集上呼吸道的口、鼻咽拭子等部位標本時，推薦採集鼻咽拭子進行病毒核酸檢測，為了提高檢測陽性率，建議採集同一患者多部位標本（口咽拭子、鼻咽拭子、鼻腔拭子等）合併檢測；對於有消化道癥狀的疑似患者，可同時採集糞便或肛拭子進行檢測［3］。 （2）標本採集保存不當，沒有正確保存、運輸和處理標本。推薦4 ℃運送標本（因RNA易降解）。 （3）技術本身原因，如病毒變異、PCR抑制等。由於2019-nCoV為單股正鏈RNA病毒，分子量大，具有易變異的特性，傳播過程中可能會產生核酸序列的變異，若處於核酸擴增的引物結合區，就會出現假陰性結果［30］。建議針對多個核酸區域進行擴增，可有效避免核酸變異對檢測結果的影響。因此，當核酸檢測結果為陰性時，只可報告本次檢測結果陰性，不可排除2019-nCoV感染，需多次重複確認［31］。 （4）患者有其他疾病，已發現類風濕因子引起IgM弱陽性或陽性的病例。 5.2.2核酸陰性，IgM陰性、IgG陽性 提示患者可能既往感染2019-nCoV，但已恢復或體內病毒被清除，免疫應答產生的IgG維持時間長，仍存在於血液中而被檢測到。 5.2.3核酸陰性，IgM弱陽性、IgG陰性 提示患者初次感染載量極低的2019-nCoV並處於早期，病毒載量低於核酸檢測下限，機體產生少量IgM，尚未產生IgG；或由於患者自身類風濕因子陽性等引起的IgM假陽性。 5.2.4核酸陰性，IgM陽性、IgG陽性 患者近期曾感染2019-nCoV並處於恢復期，體內病毒被清除，IgM尚未減低至檢測下限；或核酸檢測結果假陰性，患者處於感染活躍期。 6結語 綜上所述，相關醫療機構應儘早建立2019-nCoV血清抗體檢測技術。 抗體檢測可用於2019-nCoV核酸檢測陰性疑似病例的補充檢測或在疑似病例確診時與核酸檢測協同應用。 在COVID-19的不同疾病進展階段，核酸和抗體檢測的效率不盡相同，兩者協同使用，可取長補短，提高診斷效率，監測疾病進展。 而正確解讀聯合檢測結果，可提高2019-nCoV的快速診斷和鑑別診斷能力，更好地了解病毒載量和疾病進展，指導臨床診療工作。 （收稿日期：2020-02-25） 參考文獻略 第一作者 ... 寧雅婷 北京協和醫院臨床檢驗診斷學專業在讀研究生，《醫學參考報微生物與感染頻道》編輯。師從徐英春教授，主要研究臨床光滑念珠菌實驗室診斷、耐藥機制及其分子流行病學。新型冠狀肺炎疫情期間，高度關注新型冠病毒實驗室診斷進展。 通信作者 ... 徐英春 研究員、教授、博士研究生導師，北京協和醫院檢驗科主任，臨床生物標本管理中心主任，臨床檢驗診斷學系主任。 主要學術兼職： 歐洲臨床抗菌藥物敏感實驗委員會（EUCAST）華人抗菌藥物敏感實驗（ChiCAS）分委會主任委員，歐洲臨床微生物感染疾病學會（ESCMID）合作實驗室主任，世界華人檢驗輿病理醫師協會副會長，國家衛生計生委抗菌藥物臨床應用與細菌耐藥評價專家委員委員兼辦公室主任，國家衛計委合理用藥專家委員會抗菌藥物組副組長，國家衛計委全國細菌耐藥監測網質量管理中心負責人，中國醫師協會檢驗醫師分會常委。

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